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原位雜交儀廠(chǎng)家分享:FISH(熒光原位雜交)技術(shù)全攻略

2022-08-12 14:30:30

熒光原位雜交技術(shù)是一種應用非放射性熒光物質(zhì)依靠核酸探針雜交原理在核中或染色體上顯示核酸序列位置的方法。該技術(shù)問(wèn)世與70年代中期左右,其曾多于與染色體異常的研究,近年來(lái)隨著(zhù)FISH探針?lè )N類(lèi)的不斷增多,使得該技術(shù)逐步應用于各種領(lǐng)域。


該技術(shù)具有快速,安全,靈敏度高以及探針可長(cháng)期保存等特點(diǎn),目前已廣泛應用于細胞遺傳學(xué),腫瘤生物學(xué),基因定位,基因作圖,基因擴增及分子診斷等領(lǐng)域。以下內容原位雜交儀廠(chǎng)家帶您了解FISH(熒光原位雜交)技術(shù)的全攻略。

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1.對于FISH操作來(lái)說(shuō),那些因素比較重要?


在FISH中重要的因素是溫度、光照、濕度和各種試劑的PH值。溫度和濕度直接影響著(zhù)探針和目標DNA的雜交效率;光照影響了熒光染料的強度,因此探針要避光保存,其已經(jīng)雜交的片子可用防熒光淬滅劑封片且避光保存;各種試劑pH也要達到要求,這也直接關(guān)系到FISH的穩定性。


2.如何確保FISH操作中的溫度?


較好的措施是使用一些FISH的專(zhuān)用儀器進(jìn)行操作,如Vysis的Hybrit FISH雜交儀。如果是手工操作,先要對FISH操作過(guò)程中可能使用的一些儀器進(jìn)行溫控能力的檢查,如水浴鍋、孵箱,對其中不符合要求的要進(jìn)行更換(疾病診斷中的探針要求溫控精度在0.5度以?xún)龋?/span>


其次,要盡可能地保持操作環(huán)境溫度在20度以上,對于在冬季進(jìn)行的FISH操作尤為重要。此外對于需要預熱以達到要求溫度的試劑,在使用前必須使用溫度計對其進(jìn)行測溫。同時(shí)檢測的樣本盡量不能超過(guò)4塊。操作中的行動(dòng)一定要迅速。操作者還往往忽視一些小部件的溫度,諸如載玻片和蓋玻片。


特別是在冬季,蓋玻片本身溫度就低,加之探針的量本就不多(10ul),因此事先沒(méi)有預熱的蓋玻片會(huì )使得雜交液的溫度急劇下降嚴重地影響了探針和目標DNA的雜交效率。因此對上述小部件的要進(jìn)行預熱處理,不然會(huì )影響FISH的雜交效果。


3.使用熒光顯微鏡觀(guān)察結果時(shí),起初有清晰而明亮的信號,但隨后信號急劇衰減,幾分鐘后信號就消失了。這是探針本身的質(zhì)量問(wèn)題嗎?


正常情況下,商業(yè)化探針即使是雜交后,如保存適當,熒光信號能保持半年以上。出現上述情況主要的原因是操作觀(guān)察的過(guò)程中或是探針的保存過(guò)程中沒(méi)有采取嚴格的避光措施。


陽(yáng)光或是強的燈光都會(huì )使熒光染料發(fā)生急劇的淬滅,從而造成了觀(guān)察結果的不穩定。因此在操作和觀(guān)察時(shí),盡可能在暗室中操作,也可以在封片觀(guān)察時(shí)加入一定的antifade(抗淬滅劑)以延緩熒光素的淬滅。


4.如何配制各種試劑呢?


強烈建議使用滅菌去離子水配制各種所需的試劑。此外,配制后使用pH計檢測是否符合要求。配制的各種試劑都要采用超純級要求。每次FISH使用新的試劑,舊的試劑盡量棄置不用。洗脫液和變性液當天用當天配。


5.直標型探針和間標型探針有何不同?


為什么我們要選擇直標型探針?所謂的直標型探針是指DNA探針共價(jià)連接熒光素基團;間標型探針則是指DNA探針先與某個(gè)半抗原連接,諸如生物素或地高辛,然后半抗原與熒光素基團連接從而形成探針-半抗原-熒光素基團,類(lèi)似“三明治”的復合物。


與間標型探針相比,直標型探針具有低背景、高特異性的特點(diǎn)。隨著(zhù)熒光染料和熒光檢測技術(shù)的不斷發(fā)展,直標型探針的靈敏度也不斷提高。因而在FISH檢測領(lǐng)域,尤其是在疾病分型領(lǐng)域,探針大多采用直標型設計。


6.能對同一樣本進(jìn)行多次的FISH操作嗎?


在多數情況下,如果FISH操作沒(méi)有得到正常的結果,我們可以將探針洗去,然后使用同樣的探針進(jìn)行再次的雜交。如果我們使用的是直標型探針,還可以使用不同探針對同一樣本進(jìn)行反復雜交。針對不同的樣本,處理方法略有不同。


外周血樣本的處理:


1、使用鑷子小心地揭去雜交區的蓋玻片


2、將樣本片浸泡于70%、85%和全部的乙醇中各一分鐘以便充分地脫水。將片子風(fēng)干后就可以進(jìn)行重復的雜交了。二次雜交中建議將變性的時(shí)間縮短一半,但不得少于3分鐘。如果對同一樣本還要進(jìn)行三次雜交,變性的時(shí)間就無(wú)需減少了。對于多次雜交,復染液濃度的降低有利于保持探針的亮度。


曾有報道在同一樣本片上進(jìn)行了多達8次的FISH操作。也可對已經(jīng)進(jìn)行G帶顯色的樣本片進(jìn)行FISH操作:將樣本片浸泡于70%、85%和全部乙醇中各二分鐘以便充分地脫水。將片子風(fēng)干后就可以進(jìn)行重復的雜交了。


二次雜交中建議將變性的時(shí)間縮短一半,但不得少于3分鐘。如果對同一樣本還要進(jìn)行三次雜交,變性的時(shí)間就無(wú)需減少了。


7. FISH技術(shù)有哪些主要優(yōu)勢?


① 安全、快速、靈敏度高;


② 探針能較長(cháng)時(shí)間保存;


③ 多色標記,簡(jiǎn)單直觀(guān);


④ 可用于中期染色體及間期細胞的分析;


⑤ 可應用于新鮮、冷凍或石蠟包埋標本以及穿刺物和脫落細胞等多種物質(zhì)的檢測。


8.原位雜交技術(shù)的發(fā)展前景如何?


FISH 技術(shù)作為連接分子生物學(xué)與細胞生物學(xué)的橋梁地位已為世人所公認。


盡管目前FISH技術(shù)無(wú)法達到完全雜交,特別是在應用較短cDNA探針時(shí)存在雜交效率明顯下降的問(wèn)題,但隨著(zhù)各種新型分子探針以及精度更為高的光學(xué)顯微鏡和功能強大的計算機分析系統的不斷問(wèn)世,上述問(wèn)題將會(huì )逐步得到解決,該技術(shù)的作用正變得日益重要,應用領(lǐng)域也得以不斷擴展。FISH技術(shù)在泌尿系統腫瘤研究領(lǐng)域的巨大潛力與光明前景將引領(lǐng)我們進(jìn)入全新時(shí)代。

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